| Double-stranded DNA breaks in the
immunoglobulin V-region gene were detected at lower frequency in affinity-maturation
impeded GANP-/- mice Yousuke
Kawatani, Hideya Igarashi, Takeshi Matsui, Kazuhiko Kuwahara, Satoru Fujimura,
Nobukazu Okamoto, Katsumasa Takagi, and Nobuo Sakaguchi |
| Double-stranded DNA breaks (DSBs) at immunoglobulin V-region (IgV) genes might be involved in somatic hypermutation and affinity-maturation of the BCR in response to T cell-dependent Ag. By ligation-mediated PCR, we studied IgV DSBs that occurred in mature germinal center (GC)-B cells in response to nitrophenyl-chicken ?-globulin in a RAG1-independent, Ag-dependent and IgV selective manner. We quantified their levels in GANP-deficient B cells that have impaired generation of high-affinity antibody. GANP-/- B cells showed a decreased level of DSBs with blunt-ends than control B cells and, on the contrary, the ganp-gene transgenic (GANPTg) B cells showed an increased level. These results suggested that the level of IgV DSBs in GC-B cells is associated with GANP expression, which is presumably required for BCR affinity-maturation. |
| 免疫グロブリンの可変領域に生じるDNAの二重鎖切断（DSBs）は、抗体遺伝子の体細胞超突然変異や抗体の親和性成熟に関与すると考えられる。GANP分子がこのDSBsを制御している可能性が明らかとなり、DSBsの分子メカニズムをに迫り、ウイルス感染時における抗体産生と免疫系の細胞の生存における影響を両面から解析する手がかりを提供する。 |
| Protein phosphatase
subunit G5PR is needed for inhibition of BCR-induced apoptosis
Yan Xing, Hideya Igarashi, Xiaodan Wang, and Nobuo
Sakaguchi |
| BCR crosslinking induces B-cell proliferation and sustains survival through the phosphorylation dependent-signals. We herein report that a loss of the protein phosphatase component G5PR increased the activation-induced cell death (AICD) and thus impaired B-cell survival. G5PR associates with GANP, whose expression is upregulated in mature B-cells of the peripheral lymphoid organs. To study G5PR function, the G5pr gene was conditionally targeted with the CD19-Cre combination (G5pr-/- mice). The G5pr-/- mice had decreased number of spleen B-cells (60% of the controls). G5pr-/- B-cells showed a normal proliferative response to lipopolysaccharide or anti-CD40 antibody stimulation but not to BCR crosslinking with or without IL-4 in vitro. G5pr-/- B-cells did not show abnormalities in the BCR-mediated activation of Erks and NF-?B, Cyclin D2 induction, or Akt activation. However, G5pr-/- B-cells were sensitive to AICD caused by BCR crosslinking. This was associated with an increased depolarization of the mitochondrial membrane and the enhanced activation of JNK and Bim. These results suggest that G5PR is required for the BCR-mediated proliferation associated with the prevention of AICD in mature B-cells. |
| GANP結合分子であるG5PRをB細胞特異的に欠損したマウスでは胚中心の低形成、抗原特異的抗体産生の低下が認められた。G5PRを欠損したB細胞では、通常活性化、増殖シグナルとなる抗原刺激が、より強く細胞死を誘導した。したがって胚中心での、抗原による高親和性抗原受容体を発現するB細胞クローンの選択に異常を来たし、本来細胞死から救済される細胞が減ったために免疫応答が正常に遂行されなかったと考えられる。ウイルス感染、細菌感染における特異的抗体産生クローンの生存は免疫記憶、長期免疫維持を保つ上で重要である。 |
Generation of high-affinity antibody against T cell-dependent antigen in ganp gene-transgenic mouse N. Sakaguchi, T. Kimura,
S. Matsushita, S. Fujimura, J. Shibata, M. Araki, T. Sakamoto, C. Minoda,
& K. Kuwahara |
| Generation of high-affinity Ab is impaired in mouse lacking GANP in B cells. Here, we examined the effect of its over-expression in ganp-transgenic C57BL/6 mice (GanpTg). GanpTg displayed normal phenotype in B cell development, serum Ig levels, and responses against T cell-independent Ag, however, generated the Ab with much higher affinity against nitrophenyl (NP)-chicken ?-globulin in comparison with C57BL/6. To further examine the affinity increase, we established hybridomas producing high-affinity mAbs and compared their affinities using BIAcore. C57BL/6 generated high-affinity anti-NP mAbs (KD ~ 2.50 x 10-7 M) of IgG1/?1 and contained the VH186.2-region with W33L mutation. GanpTg generated much higher affinity (KD > 1.57 x 10-9 M) by usages of VH186.2 as well as non-canonical VH7183-region. GanpTg also generated exceptionally high-affinity anti-HIV-1 (V3-peptide) mAbs (KD > 9.90 x 10-11 M) with neutralizing activity. These results demonstrated that GANP is involved in V-region alteration generating high-affinity Ab. |
| B細胞特異的にGANPを欠損させたマウスでは抗体親和性成熟が障害される。Igプロモーター／エンハンサー制御下にGANPを発現させたトランスジェニックマウス（GanpTg）を作成した。このマウスのB細胞分化や血清Ig値、T細胞非依存的抗原反応は正常であったが、NP-CGに対する免疫応答は高親和性抗NP抗体産生が亢進していた。この親和性亢進をさらにハイブリドーマの作成によって検証した。二種類の抗原（NP-CGとHIV-1 V3ペプチド）をC57BL/6マウスとGanpTgマウス免疫して、それぞれに対するモノクローナル抗体を産生した。BIAcoreセンサーグラムで親和性を測定したところ、コントロールのC57BL/6マウスに比べてGanpTgマウスではより高い親和性の抗体が得られた。このマウスはこれまで得られなかった難知性ウイルスに対して感染阻止を行うことの出来る高親和性モノクロナール抗体を作製する技術の基盤として、広く応用可能であることが証明された。 |
Increased expression of germinal center-associated nuclear protein RNA-primase is associated with lymphomagenesis S. Fujimura, Y. Xing, M. Takeya, Y. Yamashita,
K. Ohshima, K. Kuwahara, & N. Sakaguchi |
| Lymphomas arise containing abnormalities of various differentiation stage-specific molecules. In the studies reported here, we have demonstrated abnormal up-regulation of germinal center B cell-associated GANP in various human lymphomas. Lymphomas including mantle cell, diffuse large B-cell, and Hodgkin lymphoma (HL) showed high GANP expression by immunohistochemical analysis. To study the role of GANP in lymphomagenesis, we generated mutant mice (ganp-Tg) that express the transgenic ganp gene under immunoglobulin (Ig) enhancer and promoter control. Ganp-Tg mice showed a high incidence of lymphomagenesis (29.5% in mice up to age 80 wk), with a non-B/non-T cell-surface phenotype with slight CD45R/B220 expression and Ig-transcripts of rearranged VH-DH-JH IgH loci. Lymphomas generated in ganp-Tg mice displayed similar pathological characteristics to mouse reticulum cell neoplasm or HL-like lesion. The VH sequences of individual mice demonstrated the tumor proliferation from a single or oligoclones, as found in human diffuse large B-cell lymphomas and HL in mouse. These results suggest that GANP over-expression is a causative factor in the generation of B lymphomas. |
| GANPがリンパ腫を含む様々なヒト血液系疾患において発現上昇していることを見出した。そこで、GANPの過剰発現がリンパ腫発症と関連するかをIgプロモーター／エンハンサー制御下にGANPを発現させたトランスジェニックマウスにおいて解析した。このマウスを80週令まで観察すると約30%の割合でリンパ腫を発症した。発症したリンパ腫のほとんどは表面マーカーが非B非T細胞型だったが、Igの再構成は認め、さらにV領域の解析からリンパ腫がモノクローナルもしくはオリゴクローナル由来であることが判明した。以上の結果から、GANP過剰発現はBリンパ腫発症を誘導することが示された。ヒトではウイルス感染がどのようにしてリンパ腫、肝癌、その他のウイルス発症腫瘍を引き起こすかが十分に理解されていない。このHodgkin病発症モデルマウスはヒトのEBウイルス感染によって起こるリンパ腫の原因、発がん機序を解明するために重要な情報を提供するものと期待できる。 |